葱花拌饭
DHE染色后的荧光信号如何通过显微镜或流式细胞仪进行定量分析？不同激发波长对结果判读有何影响？
DHE染色后的荧光信号如何通过显微镜或流式细胞仪进行定量分析？不同激发波长对结果判读有何影响？大家在做氧化应激相关检测的时候，是不是常碰到看不清信号、分不准强弱的麻烦？想摸准DHE染出来的荧光到底怎么算准数量、辨清差异，还得搞懂显微镜和流式各自的用法，更得注意激发波长这个小细节咋影响咱们看结果——这事儿不搞明白，实验数据可能越看越迷糊，对不？
先唠唠DHE染色的基本原理，弄明白才能读准信号
DHE这玩意儿是个能“抓”超氧阴离子的探针，进了细胞会被超氧阴离子氧化成乙锭，这乙锭能嵌进DNA里发荧光。但它本身没颜色，得靠光“激”才亮，所以激发波长和仪器匹配度直接关系信号能不能被“叫醒”。不少人刚开始做的时候，随便选个波长就染，结果要么信号弱得像没染，要么背景杂得没法看，根源就是没摸透它“要啥光才肯亮”的脾气。
显微镜下的DHE荧光定量，得盯着“亮暗”和“范围”算清楚
显微镜看DHE是靠镜头“凑近了瞧”，适合先看细胞的样子，再数清楚哪些细胞有荧光、亮到啥程度。但定量不是凭眼睛瞅，得按步骤来：
- 先把仪器调对“胃口”：DHE常用的激发波长有480纳米（蓝光）、518纳米（绿光），得跟显微镜的滤光片配对——比如用480激发就得配510-550的发射滤光片，不然光没接住，信号要么暗要么偏色。我之前帮实验室新人调的时候，他一开始用500激发配520发射，结果拍出来的图一片灰，换了480+515发射，立马看清红色荧光点了。
- 选对定量方法，别瞎数：
- 要是看单个细胞亮度，就用平均荧光强度（每个细胞的总荧光除以面积），能反映细胞里超氧阴离子的多少；
- 要是统计有多少细胞“变亮了”，就用阳性细胞率（发荧光的细胞数÷总细胞数×100%），适合看一群细胞里氧化应激的比例。
举个例子，测炎症细胞里的超氧阴离子，用平均荧光强度能看出哪个细胞“应激更狠”，用阳性率能知道炎症里有多少细胞在“干活”。 - 背景要扣干净，不然数据“注水”：得拍一张没染DHE的细胞图当背景，算的时候把背景荧光减掉——就像拍照要擦干净镜头上的灰，不然拍出来的人像脸是脏的。我见过有人没扣背景，把细胞本身的 autofluorescence（自发荧光）算成DHE信号，结果阳性率多算了20%，白忙活一场。
流式细胞仪的DHE定量，靠“流速里的精准计数”
流式是让细胞“排着队过光”，一个个测荧光，适合处理大批量样本（比如上百管细胞），定量更偏向“群体统计”。但它的关键在“设门”和“校准”：
- 电压与补偿要“稳”，不然信号“飘”：流式得调PMT电压（光电倍增管电压），让DHE的荧光信号落在合适的通道里——电压太高会“饱和”（信号顶到最大值，分不出强弱），太低会“漏信号”（弱荧光测不出来）。还有补偿，要是同时染了其他荧光染料（比如PI染死细胞），得把串色去掉，不然会把PI的红当成DHE的红。我之前做双染实验，没设补偿，结果死细胞的PI信号混进DHE通道，阳性率多算了15%，后来调了补偿才准。
- 定量指标看“两个数”：
- 中位荧光强度（MFI）：把细胞按荧光从弱到强排，中间那个细胞的亮度，适合比较不同组的整体氧化水平（比如药物组和对照组的整体应激差多少）；
- 阳性群比例：荧光超过设定阈值的细胞占比，和显微镜的阳性率类似，但流式的统计更准（能测几万细胞）。
- 样本处理别“作妖”，不然堵管子还不准：细胞浓度要合适（一般1×10^6/ml），太浓会堵流式管，太稀测不到足够细胞；染色时间别太长（15-30分钟，37℃），不然DHE会自己氧化，背景变高。我同事有次染完放了1小时才上机，结果MFI比刚染的高一倍，就是因为DHE提前“醒了”。
激发波长咋影响结果判读？选不对等于“看错戏”
DHE的荧光强度和激发波长的关系，像“钥匙开对锁才管用”——不同波长激出来的亮度和颜色不一样，直接影响咱们判断“这个细胞有没有应激”“应激有多重”：
| 常用激发波长 | 对应发射波长 | 荧光颜色 | 适用场景 | 注意事项 |
|--------------|--------------|----------|----------|----------|
| 480nm（蓝光）| 518nm（绿光）| 橙红色 | 显微镜（配CCD相机）、流式（蓝激光通道） | 信号强，但容易受细胞自发荧光干扰（比如红细胞、衰老细胞） |
| 518nm（绿光）| 605nm（红光）| 深红色 | 共聚焦显微镜（配红激光）、部分流式（绿激光通道） | 特异性好，能避开部分自发荧光，但信号稍弱，需提高激光功率 |
| 540nm（黄光）| 620nm（红光）| 暗红色 | 特殊需求（比如同时染绿色探针） | 很少用，信号最弱，容易漏检弱阳性细胞 |
比如测神经元里的超氧阴离子，用518激发的深红色荧光，能避开神经元的自发绿荧光，结果更准；但测巨噬细胞（自发荧光弱），用480激发的橙红色信号更强，更容易看到弱阳性细胞。波长选错了，要么把“没应激”看成“应激”（假阳性），要么把“应激重”看成“没应激”（假阴性）——我之前用480测皮肤成纤维细胞，因为成纤维细胞自发荧光强，结果把好多正常细胞算成阳性，换成518后，阳性率从45%降到12%，才贴近真实情况。
实操里的常见坑，帮你提前绕开
问：为啥我染出来的荧光一会儿强一会儿弱？
答：要么是激发波长没固定（比如今天用480明天用500），要么是染色时间没卡准（短了没反应够，长了自发氧化），再要么是仪器没校准（比如流式的PMT电压每周得用标准微球调一次）。
问：显微镜和流式，到底选哪个定量？
答：看需求——想看细胞形态+局部定量（比如肿瘤细胞里的应激灶），选显微镜；想大批量统计+群体趋势（比如药物对100个病人的PBMC的影响），选流式。两者结合更好：先用显微镜确认信号位置对不对，再用流式算群体数据，避免“只看局部不看整体”。
问：激发波长选518就一定比480好吗？
答：不一定。要看样本的自发荧光特性——比如淋巴细胞自发荧光弱，用480信号强，更敏感；比如肝细胞自发荧光强，用518能避开干扰，更特异。最好先做预实验：用两种波长各染一组细胞，看哪种的信噪比（信号÷背景）更高，选高的那个。
做DHE定量，其实就是“顺着它的性子来”——先搞懂它要啥光，再选对仪器的用法，最后把波长匹配好。我做了五年氧化应激实验，最大的体会是：数据准不准，不在仪器贵不贵，在你有没有摸透“探针和仪器的小默契”。比如新手常犯的“波长乱换”“不扣背景”“没校准仪器”，其实改改操作习惯就能避免。现在实验室里的新人跟着这些方法练，基本不会再把“没染上”看成“全阳性”了——毕竟，把基础打牢，比急着出结果更重要。
【分析完毕】